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ELISA实验前的注意事项

更新时间:2018-06-09 17:00    浏览量:    作者:管理员    来源:本站

  为了帮助您更好地解决在实验中可能碰到的各种问题,我们设计了这些问题指导,配以试剂

  盒内的说明书一起供您参考使用。很多因素都将导致免疫测定实验的失败,而大多数技术

  失误是可以通过全面阅读和准确理解说明书以及实验步骤来避免的。若对试剂盒内的说明书有任

  何意见和建议,欢迎反馈。我们期待听到您的声音,从而完善我们的产品,更好

  地为您服务。

  ◆仔细阅读说明书

  ◆检查试剂盒标签上的有效期。如果超过有效期,请勿使用。

  ◆按说明书确定所有试剂齐全(数量、体积)

  ◆标本制备要规范,每份标本体积要按2-3个复孔以上的量制备(贮存),尽量分装做备份。

  短期内无法实验者,注意低温保存

  ◆准备好所有实验额外所需物品, (比如移液器,试管,清洗器, 酶标仪)

  ◆按说明书将所用试剂平衡至室温,根据检测标本数量确定所需试剂的量

  ◆检查试剂盒内每种试剂的贮存条件,保证所有试剂均按照试剂盒内说明书推荐的条件存储。

  ◆检查不稳定或者变质的试剂溶液(比如沉淀或变色)。有些试剂,比如标准品稀释液或者检

  测稀释液,可能在设计时就含有沉淀物。所有试剂在滴入酶标板之前,必需充分混匀。而由

  于沉淀物的特性,在加入酶标板之前,必需不停搅拌。

  ◆保证充分的孵育时间和温度。

  ◆切勿使用不同生产批号的试剂取代现有试剂或混合现有试剂。

  ◆在混合或溶解蛋白溶液时,避免泡沫产生。

  ◆在实验开始之前,安排好实验流程。

  ◆在实验开始之前,清洁工作台。

  ◆若有问题,应与我公司或代理商的技术支持联系

  洗板方法(Washing Techniques)

  任何一个成功的ELISA检测,正确的洗板方法是非常关键和重要的一方面。连贯的洗板也是

  很有必要的。在稀释浓缩洗涤液时,请使用去离子水或者蒸馏水。

  ◆洗涤瓶或多通道移液器

  保证洗瓶内压强良好或者移液器的管头被适当调整并且无碎屑。检查板内的板条是否安放完

  好。将板条编号以防在倾泄的时候松动便于调整。首先,倾泄酶标板以清空内容物。根据试

  剂盒内推荐的体积向每孔内滴加洗液。若实验步骤中要求浸泡,则定时将每孔浸泡完全。将

  板内液体倾倒完全,用干净纸巾擦拭。按照说明书所示重复以上步骤。最后一次洗板之后,

  将板内液体倾倒完全,用干净纸巾拍打表面并擦干。切勿让孔内干燥。按照试剂盒内说明书

  迅速进行下一步实验操作。

  ◆自动洗板仪

  将自动洗板仪接入适当真空(根据制造商的说明)。确保每管都被适当抽吸。首先,通过抽

  吸或者倾倒将板清空。根据试剂盒内推荐的体积向每孔内滴加洗液。若实验步骤中要求浸泡,

  则定时将每孔浸泡完全。完全抽吸各孔,保证没有洗液残留。在孔内液体被完全抽走之后不

  要再将装置至于孔内过分抽吸。按照说明书所示重复以上步骤。最后一次洗板之后,将板内

  液体倾倒完全,用干净纸巾拍打表面并擦干。切勿让孔内干燥。按照试剂盒内说明书迅速进

  行下一步实验操作。

  移液注意事项

  ◆反复而准确移液的关键是连贯的操作。流畅而迅速的移液操作是非常重要的。吸液和释放液

  体是都要避免剧烈的移动。

  ◆检查枪头大小是否合适,是否固定完好。

  ◆在滴加样品或试剂时,每次更换枪头。

  ◆请勿转移小于移液器生产厂家推荐的最小体积的液体。 否则将会降低实验的准确性和重复

  性。

  ◆某些液体易于附着在枪头的内外表面上,所以,最好预先洗涤枪头以避免由于这种表面张力

  而引起的液体体积变化。这样会增加移液的准确性。

  ◆若果需要移动的液体是粘稠的,在吸取液体时,请在待取液体中停留一段时间,待体积达到

  平衡后再移出。

  ◆用移液器吸取液体之后,用不含棉的绒纸片擦干枪头的外表面。

  ◆在吸取液体时枪头内如果出现气泡,排出已吸液体并重新从容器中缓慢吸取一次。如果枪头

  内依然出现气泡,则更换枪头。

  ◆在吸取液体时枪头内如果出现泡沫,则轻微倾斜移液器,并缓慢吸取液体。

  ◆每种试剂均分开配制贮存

  样本信息(Sample Information)

  我能否在实验开始前一天收集样品?

  ◆除非试剂盒内说明书特别说明不允许,一般都可以。如果收集的样品不能够及时进行检测,

  请保存至-20℃或者按照说明书进行保存。应避免反复冻融。

  ◆-20℃是推荐的冷藏保存温度。解冻的平衡过程可能会导致样品的降解。

  我是否必需按照试剂盒内说明书中的方法准备样品?

  ◆推荐的样品准备方法是经过实验验证的最佳的方法,所以推荐按照说明书上的方法制备样

  品。

  我能否不用推荐的收集方法来收集血浆?

  ◆每一次按照推荐步骤操作的测定都是经过验证可行的。在某些测定中有些抗凝剂是不被推荐

  的。具体请参看说明书。

  ◆有些待检测的分析物也存在于血小板中,因此,推荐使用低血小板血浆。正确的收集操作方

  法请参看说明书。

  我能否使用自己的稀释液或者缓冲液?

  ◆每个试剂盒中都含有按配方配制的与特异性样品种属相配套的稀释液,以确保待检测的样品

  被正确稀释。具体请参看说明书。

  建议

  ◆确定待检测的样品在收集和制备时保证无菌操作。

  ◆如果要检测多个样品,将样品隔离并标记清楚以防相互污染。

  ◆检测前,将样品离心除去颗粒。将样品转移至新的离心管内,混合均匀。

  ◆在混合样品时,使用容积至少比样品体积大50%的离心管以保证混合充分。

  我没有足量的稀释液去稀释所有的样品,怎么办?

  ◆试剂盒内提供说明书中所指定的足量的稀释液。能保证所有的标准品和样品检测两次。

  ◆如果没有推荐的稀释度,或者需要大量稀释,请在实验前计算出所需的稀释液总量,然后联

  系技术服务部门获取额外的稀释液。

  我能否使用试剂盒内非推荐的样品类型?

  ◆试剂盒内说明书中所指定的样品类型是经过验证可行的。其它未推荐的样品类型是没有经过

  任何检测的。

  我使用对照的检测结果都在范围外,为什么?

  ◆如果使用对照,其浓度应该是在某一特定范围内。如果对照值在范围外,则是无效测定。

  ◆确定对照具有重复性。

  我是否可以将试剂盒中说明书的样品数据作为参考?

  ◆说明书中的样品数据是从有限的检测个体中得出,只能作为大概的指导。

  我是否可以省略说明书中标准曲线的标准品值?

  ◆不可以。样品值必需由每次检测的标准曲线决定。

  如果是手绘标准曲线,我怎样决定样品浓度?

  ◆要决定每个样品的浓度,首先找到Y轴的光度值或者相对光单位,然后作水平线至标准曲线。

  在交点处,作垂线至X轴,读取相应浓度。

  我怎样补偿样品的稀释度或者浓缩度?

  ◆如果样品是稀释型的,标准曲线所读取的值必需乘以稀释度。

  ◆如果样品是浓缩型的,标准曲线所读取的值必需除以浓缩比。

  我怎样将样品值的单位转换成Units?

  ◆如果可以使用NIBSC/WHO国际标准,可使用说明书中介绍的相应的转换方程进行转换。插

  入你的样品值到方程中将pg/mL或者ng/mL转换成Units。

  我检测到的样品值在测定实验的动态范围之外,我是否可以用这些数值?

  ◆只有随标准曲线降低的样品值才被推荐使用。在标准曲线范围外的值都是非线性的,会导致

  错误的外推值。

  ◆如果测定的样品值比最高的标准品的值还要高,则此样品需要进一步的稀释并重新进行检

  测。

  ◆如果测定的样品值远低于测定范围,则样品被认为是无法被检测。

  我的标准曲线看上去还不错,但是却没有达到我预期的结果,为什么?

  ◆样品可能不含有待分析物。

  ◆稀释液的影响可能遮蔽了检测。确保采用说明书推荐的稀释度。

  ◆如果确实采用的是推荐的稀释度,则检查稀释操作是否正确。过度稀释将导致样品值低于标

  准曲线范围。

  精确度/重复性(Precision/Reproducibility)

  免疫测定的精确性可由酶标板孔之间的重复性和每次检测之间的重复性决定。由高CV值引起的

  低精确度一般由两个因素引起:移液操作和洗液操作。

  我需要在孔内混合试剂吗?

  ◆当多种试剂滴加至一个孔内时(比如稀释液和样品),需要在孔内进行混合。滴加试剂和样

  品至每孔的中心,轻拍酶标板使其充分混合。

  我的试剂/样品是粘稠状的,不易于吸取移动,怎么办?

  ◆在吸取粘稠液体时,请在待取液体中停留一段时间,待体积达到平衡后再移出。

  ◆用相应试剂预洗涤枪头以补偿液体的表面张力。

  微量移液器

  ◆枪头中的液体体积不足或者不均匀,表明移液器需要被校准。检查移液器的功能,必要时重

  新校准。

  ◆在滴加试剂,标准品,样品时应及时更换枪头以避免互相污染。

  ◆检查枪头是否安装完好。如果安装不得当,可能会导致吸液和排出液体是体积不准确。

  ◆从容器中移出枪头时,将枪头轻靠在受液容器壁上移去残留在枪头外表面的液体。

  正确洗板方法

  ◆如果使用自动洗板仪,抽吸装置或者多道移液器。 确保每管都被适当抽吸。在孔内液体被完

  全抽走之后不要再将装置至于孔内过分抽吸。按照说明书所示重复以上步骤。最后一次洗板

  之后,将板内液体倾倒完全,用干净纸巾拍打表面并擦干。

  ◆洗板太快或者太慢,不完全洗板或者抽吸。

  ◆孔内干燥等各种因素都将影响检测结果的准确性。按照试剂盒内说明书迅速进行下一步实验

  操作。

  我是否可以使用同一容器盛放所有的试剂?

  ◆不可以。请使用不同的容器盛放不同的试剂以避免污染。

  ◆有些待分析物对污染极其敏感(比如唾液,氧化试剂等等)。根据说明书,注意预防试剂盒

  内试剂污染。

  我可以重复使用盖板吗?

  ◆再利用的盖板上可能含有上一步骤的残留物,可能会污染孔内现有的成分从而导致精确性降

  低。所以在每次孵育的时候使用新的盖板。很多因素都能影响标准曲线的结果,其中就包括

  制备和操作。

  标准曲线(Standard Curve)

  很多因素都能影响标准曲线的结果,其中就包括配制和操作。

  我是否可以改变标准品的配制?

  ◆不可以。 用指定的稀释液适当稀释的重组标准品如说明书中所示。

  ◆混合和溶解标准品时,应避免起泡。

  ◆溶解后的标准品最好静置至少15分钟(根据说明书)。在使用之前轻轻混匀,保证所有的

  固体已经溶解。

  ◆制作标准曲线时,确保所有的稀释步骤已经准确完成。稀释时注意及时更换枪头。在移液之

  前将稀释液充分混合。

  洗涤方式怎样影响我的标准曲线?

  ◆不完全的洗涤会降低测定精确性,导致不理想的标准曲线结果。确保洗板机的正常工作,确

  保酶标板各孔被充分洗涤却不干燥。

  移液方式怎样影响我的标准曲线?

  ◆不合理的移液操作会导致高CV值和不理想曲线。

  ◆在制作标准曲线的过程中,不正确的移液方式会导致错误的稀释,从而使错误的数值进入标

  准曲线中,或者产生非线性曲线。确保移液器正常工作。每孔中的液体体积不等可能就是移

  液器失灵或者枪头使用不当所致。

  我的电脑软件不支持推荐的数据归纳方式,我是否可以用其它的?

  ◆可以,然而,每次测定最好使用说明书中推荐的数据归纳方式。使用不同的数据归纳方式会

  导致结果的浮动。

  ◆对于不同的计算机软件,将标准品的吸光度设定为Y轴,浓度设定为X轴。用对数纸作出的

  数据应该是线性的,回归分析被应用于对数变换。如果不能使用对数纸,则将浓度的对数和

  OD值的对数进行线性作图。最适曲线由回归分析决定。

  测定多个酶标板时是否可以使用同一条标准曲线?

  ◆在测定不同板中的样品时,每一个板都对应一条标准曲线。技术错误或者不同的孵育情况,

  环境条件都会引起酶标板之间产生不同结果。一条标准曲线测定的样品值必需是在相同环境

  下产生的,否则就是无效值。

  我的标准曲线是平的或者是非线性的,这可能是由于什么原因引起的?

  引起不理想的标准曲线的原因有很多,最常见的原因例举如下:

  ◆确定稀释是否得当。

  ◆确定波长是否正确。

  ◆标准品和样品必需在15-20分钟内滴加入板内。(除非试剂盒内说明书特别说明)

  ◆检查背景是否过高。

  ◆确定酶标板是否正确洗涤。 不恰当的洗涤可能会引起具有高背景的平直曲线。

  ◆在测定过程中重复读板。在超过建议时间后读板会导致错误的结果。

  ◆如果最高的标准品的读数超过了酶标仪的范围,确定标准品是否正确溶解,孵育时间和温度

  是否准确。

  ◆为保证实验准确性请重复测定。

  ◆如果使用对照,对照的浓度必须在测定范围内。

  ◆在检测和孵育过程中确定试剂没有被污染。

  ◆没有任何信号的平直标准曲线可能是由于酶结合物或者底物没有反应。 检查各个操作过程

  ◆由于许多酶标仪的限制,因此建议标准品检测由高向低做复孔。

  边缘效应(Edge Effect)

  边缘效应的定义是酶标板孔内中心部分与酶标板孔内远离中心部分之间相比存在明显的信号差

  异, 一般归因于两个主要因素。

  孵育环境确实对实验有影响吗?

  ◆是的。孵育时温度不均会引起边缘效应。请严格按照推荐的温度进行孵育。如果条件允许,

  可以在能够控温的孵育器中进行孵育。

  ◆在使用之前将所有试剂平衡至室温。(除非特别说明)

  ◆在实验开始之前检查工作的环境温度。如果曲线很平直,可能是由于工作环境温度低于气温

  所致。

  在孵育末期我注意到盖板一侧突起来了,这是否会影响我的实验结果?

  ◆盖板如果使用不恰当会导致边缘效应。

  跳孔(Drift)

  跳孔的定义是酶标板从左侧到右侧的孔或从上到下的孔内信号出现显著的倒置现象

  我刚配置试剂的时候中断了,这是否会影响我的实验结果?

  ◆这可能会导致产生波动的曲线。在移液之前确定所有的标准品或者样品是否配制完好。请在

  试剂配制完的15-20分钟内滴加入板内。(除非特别说明)

  我是否需要一个多道移液器?

  ◆在配制诸如底物, 酶结合物,或者稀释液的时候,最好选择连续或多道移液器。

  如果我没有平衡试剂会怎样?

  ◆没有平衡的试剂会导致孔之间温度不均,使整个酶标板的信号产生变异。除非特别说明,试

  剂一般在使用之前都要平衡至室温。

  ◆每次检测都会有推荐的孵育时间和温度。 冷冻的试剂一般需要更长的孵育时间。所以最好使

  用说明书上推荐的孵育温度和时间。

  我是否需要盖板?

  ◆参看试剂盒内说明书。如果说明书内的实验步骤中有推荐使用盖板,则在使用时应选用与酶

  标板配套的盖板,使边缘与酶标板紧密契合。如果盖板的一边突起,则会产生信号的差别。

  酶标仪的设置怎样影响我的结果?

  ◆对于底物测定,如果读数时间等于或超过2秒/孔,使从第一孔到最后一孔在读书时存在时间

  上的延误,会导致结果的异变。在底物反应阶段,辣根过氧化物酶会一直作用直到底物反应

  完全。而由于时间的延误,底物越来越少,底物反应也受到影响。将酶标仪的读数时间设定

  为1.0秒/孔。

  我是否可以根据自己的方案来调整孵育时间?

  ◆更改孵育时间或温度会导致检测不能达到平衡或过度反应。请按照说明书推荐的孵育时间和

  温度操作。

  ◆如果同时进行多项检测,对每孔必需分别计时已避免孵育不足或过度孵育。

  信号变化(Signal Development)

  信号的变化受以下几个因素影响:底物,孵育时间, 酶结合物和底物反应失败,波长和仪器。

  我是否可以更改底物处理的方法?

  ◆如果反应物溶液需要混合,确保加入的反应物试剂体积正确并充分混合。混合后的溶液必需

  在15分钟内使用(化学发光检测最多4小时)。如果反应物混合得太早,则在容器中的颜色

  可能会发生变化。

  ◆如果底物是冻干品或片剂,则根据说明书中的方法用适当体积的稀释液将其完全溶解。混合

  完全后并在说明书中推荐的时间内使用。

  我在移液的时候是否要按照一定的顺序?

  ◆根据说明书中的顺序进行移液操作。

  ◆高灵敏度检测利用了放大系统。在底物孵育完成之后,按照加底物的顺序依次加入放大试剂。

  ◆底物加完之后,轻拍酶标板使其充分混合。

  底物有可能被污染吗?

  ◆是的。如果测定时使用的是碱性磷酸酶或者辣根过氧化物酶标记的结合物,在测定时要注意

  避免污染。污染可能会导致产生超过酶标仪范围的值。避免与金属或氧化试剂接触。使用新

  容器。

  底物是否需要在黑暗环境中进行孵育?

  ◆不需要。不过在孵育过程中应避免阳光直射。

  温度怎样影响结果?

  ◆碱性磷酸酶或者辣根过氧化物酶都是光敏感型酶。光密度单位或者相对光单位都会随着温度

  的改变而变化。

  ◆避免在环境条件变化剧烈的地方孵育。(比如通风口,窗口这些温度和光照都剧烈变化的地

  方)

  为了保证酶结合物和底物反应完全:

  ◆对于比色法测定:

  将同体积的结合物和底物溶液充分混合(对于高灵敏度的试剂盒,在加入同体积的结合物和

  底物一分钟之后,再加入等体积的扩增剂)。颜色若不是立即显现,则检查所加成分是否在

  正确的贮藏温度下保存,是否被污染,是否在有效期内。

  我是否需要校正波长?

  ◆对于比色法测定,需要通过校正波长来减少误差。

  如果我没有校正波长应该怎么办?

  ◆将所读波长减去原始校正波长。这个方法可以更正光学误差。

  我的酶标仪上没有说明上推荐的那种用来校正波长的滤光片,我可以用别的吗?

  ◆可以。只要选择的波长高于推荐的校正波长即可。

  我的酶标仪没有说明书上推荐的波长,我可以用别的吗?

  ◆推荐波长由使用的底物和反应后颜色的峰吸收度决定。说明书上一般都有相应数据,如果没

  有,则选择最接近的波长。不过,这种数据变化比较大。

  为什么我的相对光单位与说明书上的不一致?

  ◆由于工业上对于光单位的衡量没有统一的标准,所以相对光单位在酶标仪之间的变化非常

  大。相对光单位的数值应该具有可比性。

  ◆使用推荐的酶标仪设置,如果使用不同的酶标仪则进行相应的等值设置。不同的设置会产生

  不同的信号。

  ◆在读数窗口准确读数。

  我是按照实验步骤进行测定的,但是没有任何信号,为什么?

  ◆对于使用HRP底物的比色测定,终止液的加入会使底物变色。而说明书推荐的波长就是最

  适波长。

  ◆通过轻拍酶标板的边缘充分混合孔内试剂。加入终止液的时,颜色由蓝变黄(如果是HRP

  底物) 。如果加终止液之前孔内试剂没有混合,则底物颜色变绿。

  ◆可能加入试剂的顺序错误。

  ◆加入底物溶液以后不要清洗酶标板。

  ◆在连续稀释时确定已经加入标准品。

  ◆如果底物系统中有两个成分,则必需混合均匀。

  ◆确定酶标仪的使用和操作正确。

  ◆确定试剂,标准品,样品都正确配制并按照说明滴加无误。

  ◆对于高敏感性试剂盒,确定使用的底物和放大剂都正确稀释。

  引起高背景的原因有哪些?

  ◆孵育时间和温度的改变。

  ◆不恰当的洗涤。

  ◆试剂被污染。

  ◆孵育时酶标板被污染。

  ◆盖板,容器或者枪头的重复使用。

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